无菌室人员更衣的确认

我G《规范》(1998 年修订)在“卫生”一章中要求“工作服的选材、式样及穿戴方式应与生产操作和空气洁净度级别要求相适应，并不得混用。无菌工作必须包盖全部头发、胡须及脚部，并能阻挡人体脱落物。”欧洲GMP 对无菌产品生产的着装要求有严格的规定，参见表2—18。
表2—18 欧洲GMP 对无菌生产的着装要求
洁净度级别着装要求
A、B 级
①面罩应能完全遮住头发、胡须，面罩下沿应藏到*口中去
②灭毒口罩、无尘手套、灭毒或消毒的鞋套
③裤脚塞人鞋套，袖口塞人手套中
④无菌衣不能脱落纤维和颗粒性物质，并能阻挡人体散发的尘粒
C 级
①头发、胡须应全部遮住
②单层或双层裤装，腰部扎紧
③合适的鞋子或鞋套
④工作服不能脱落纤维和颗粒性物质
D 级
①头发、胡须应全部遮住
②一般的防护工作服
③合适的鞋子或鞋套
④有适当措施防止来自洁净室外的污染
注：1．外界衣物不能带到A、B 级的更衣室(应换上工作服后进入)。
2．上述洁净室不得带人手表、化妆品和shou饰。因此所有需进入无菌实验室和无菌制造区(包括100 级及10 000 级区域)工作的操作工、机修工、QC／QA 取样人员必须接受更衣程序的确认，并公布合格者的名单，同时规定时效，超过时效必须进行再次确认，以确保进入无菌室的所有人员是“会穿无菌衣”的。有条件的话，QA 部门应摄下每个人的更衣程序并加以保存，作为染菌的研究资料，定期进行检查。
一、建立更衣的标准操作程序
人员进入无菌区先得通过气闸室，但人既不能灭菌、除菌，也不能消毒，以致成为污染无菌环境的主要威胁。无菌的衣服、鞋套、手套、帽子、口罩以及眼镜对所有要进入无菌区的人来说是**必需的。由于无菌服饰可能是控制微生物污染的**好办法，所以必须教会人们穿戴服饰的正确办法。更衣的标准操作程序(SOP)必须完备并在任何时候都应坚持。更衣程序可因各单位的具体情况而定。例如，用长凳将更衣室一分为二的穿衣程序一般为：
①把需穿着的无菌服置于长凳上。
②一只脚先套上鞋套，把腿横过长凳，在此之前必须确保鞋套未触及**间(洁净级别较低的)地面。另一只脚重复此动作。
③先戴头罩然后穿衣，必须注意不能将衣服的任何部分触及地面。拉紧拉链，齐整衣服，
裤脚应覆盖鞋套，袖套须覆盖整个手臂直**手腕，头罩要小心地塞进颈部。
④用口罩遮蔽鼻、口，并缚紧。
⑤在全身镜前检查着装，检查在无菌衣上是否有开口处，按要求作**后整理。
⑥**后戴上无菌手套，手套上部紧缚住袖口。
二、人员的发菌量
分析G外实验资料，可以认为人员的发菌量有以下数据可供参考。
①洁净室内当工作人员穿无菌服时，静止时的发菌量一般为10～300 个／(min ·人)，躯体一般活动时的发菌量为150～1000 个／(min ·人)，快步行走时的发菌量为900—2500 个／(min ·人)。
②咳嗽一次的发菌量一般为70～700 个／(min ·人)，喷嚏一次的发菌量一般为4000～60 000 个／(min ·人)。
③穿平常衣服时发菌量为3300～62000 个／(min ·人)。
④无口罩发菌量：有口罩发菌量为(1：7)～(1：14)。
⑤发菌量：发尘量为(1 ： 500)～(1：1000)。
可知洁净室内穿无菌衣人员的静态发菌量一般不超过300 个／(min ·人)，动态发菌量一般不超过1000 个／(min ·人)。
三、更衣的确认程序
1．确认的程序
①每个受训者事先必须先经过无菌操作的培训，如无菌衣穿着的SOP，接触法取样的方法，污染控制和无菌操作技术等。
②进入无菌室前，受训者先要进行更衣的实践。
③管理人员必须向每个受训者解释更衣微生物挑战试验的程序。
④将微生物挑战试验用在3 次更衣程序上。受训者经过3 次更衣练习，直到达到“会穿衣进入无菌室”的程度。
⑤每次挑战性试验用Rodac 直接接触法取样，取样点如下：
——每个手套(5 只手指)；
——胸口处(在拉链中心**少有1 点)；
——口罩；
——帽兜额头处；
——防护眼镜(2 块镜片)；
——靴子与工作裤接口处(左右各1 点)；
——前臂。
2．频率
①每个受训者必须经过3 次更衣试验达标后才能进入无菌室。
②更衣已合格的操作工每年需重复一次更衣试验，尚未进入无菌室的人员每4 个月重复一次。
③当发现合格人员中有违反更衣程序趋向时，须重复l～3 次更衣试验。
3．更衣合格标准
①已证明受训人掌握了更衣程序、污染控制和无菌技术。
②资料和录像显示出受训人3 次更衣试验的程序都是正确的。
③3 次试验的微生物检测结果在合格标准内。参考合格标准如下表所示。采样点参考标准(Rodac 法)／CFU·皿”采样点参考标准(Rodac 法)／CFU·皿”
采样点        CFU·皿        采样点        CFU·皿
手套        ≤3        前额        ≤5
胸口        ≤5        眼镜        ≤10
前臂        ≤5        靴子—裤子接合处        ≤5#p#分页标题#e#
口罩        ≤10
 
 
 
 
 
 
 
 
关于无菌工艺验证

典型的无菌原料药精制生产工艺为：将原材料配制成溶液－除菌过滤－结晶－过滤－洗涤－干燥－粉碎－分装。
在上述的灭菌生产工艺中，除了除菌过滤外，还包括设备灭菌、包装材料灭菌、无菌衣物灭菌等等。这些灭菌过程经过验证能保证从非无菌状态转化成无菌状态。但是无菌原料药的生产过程是精制过程和上述这些灭菌过程的组合，或者称之为无菌工艺，这种无菌工艺只有经过验证才能确保产品的无菌性能可靠。验证过程一般是选择合适的介质模拟生产流程，使介质流经整个生产系统，然后对模拟介质培养，观察是否有细菌长出。如果系统中有染菌的因素存在，在对模拟介质的培养中就会被发现。

1 验证前的准备

无菌工艺验证是生产、质量、工程和其它部门之间广泛合作的一项工作。在验证之前需要做一些准备工作。

1.1 生产设施的设计和确认
生产设施的设计应能使潜在的污染降低到**小。生产设施应易于清洁和消毒；产品或物料敞开之处的空气要有一定的品质要求；温度和湿度的控制要适宜，使穿着无菌衣的操作人员感到舒适，应能防止污染和交叉污染等等。其中单一因素对无菌操作的具体影响也许并不是很明显，但如果设施设计不够全面，这种影响将非常显著。应重视设计上的细节，减少污染源，以确保无菌生产得以实施。无菌工艺验证是执行难度较大的验证之一，参与者应充分意识到设施的设计和确认是验证成功的主要因素。

1.2 公用工程的确认
影响产品质量的公用工程如蒸汽、压缩空气、加热、制冷、水系统等都应经过确认。公用工程是生产得以正常实施的保证之一。若其中任何一个系统出现故障，将会使产品发生潜在的或严重的污染。应有公用工程的维护计划并按计划执行，目的就是不让系统发生故障，保证生产的顺利进行，而不是发生故障后去修理。经常发生故障而被维修的公用工程是不能保证无菌生产的。

1.3 设备和工艺确认
在本验证实施之前，所有的设备、无菌环境、计算机控制系统以及生产工艺都应经过验证。产品暴露是发生污染使无菌工艺验证失败的主要原因之一，为防止或降低污染发生的几率，给暴露产品提供层流空气的百级层流罩是非常重要的；被灭菌过的物品由灭菌器到生产线的传递和经由必要的手工操作进入生产线前的保护也是**关重要的，应尽量避免人员对设备或物料的接触的操作。这些都应经过验证。

1.4 设备的清洗和灭菌
在无菌工艺验证之前接触模拟介质的设备表面应清洗灭菌，并防止灭菌后的再污染。若生产的药品具有抗菌性或者杀菌性，这种清洗尤为重要。若清洗或灭菌不彻底，残存的药品会使模拟介质受到污染或设备表面的微生物使模拟介质染菌而使验证失败。这种清洗和灭菌过程应经过验证，能保证清洗彻底和灭菌成功。

1.5 模拟介质的选择
选择的模拟介质应有如下特征：没有抑菌作用。这是显而易见的，若模拟介质有抑菌作用，将会对生产系统中的细菌生长产生抑制作用，以**于不能培养出细菌，产生假的结果。模拟介质**好具有促进细菌生长的作用。如果选择对细菌生长有促进作用的固体培养介质做验证，对生产环境的保护则特别重要。因为如果有些操作是使介质暴露的，介质的尘粒会飘散在某些较难清洗的地方，如空调系统的送风口和回风口附近，给细菌在该处的滋生创造了条件，所以应有措施保护不易清洗的死角不被介质污染。模拟介质还应在培养基内有较好的溶解度。因为若溶解性能不好，悬浮在培养基中的模拟介质使培养基发生混浊,影响结果的判断。模拟介质加入培养基后，不应影响培养基的质量，pH不发生大的变化，以适应大多数细菌的生长。对设备没有腐蚀性，对人体无害，对环境不发生污染。基于以上分析,通常可供选用的模拟介质有PEG4000、PEG6000、乳糖和甘露醇等。

1.6 培养基
一般来说，应针对不同的微生物选择不同的培养基，比如硫乙醇酸盐培养基适用于需氧菌和厌氧菌，大豆酪蛋白消化物培养基适用于需氧菌和真菌。在无菌工艺验证中事先不知道系统中存在什么样的微生物，但分别选择多种培养基分别做无菌测试也较难做到。应根据实际的生产工艺和生产环境选择适用于大多数微生物生长的培养基。比较之下，推荐用大豆酪蛋白消化物培养基，因为大多数无菌原料药的生产都和空气接触，污染厌氧菌的几率很小，而且被污染的微生物大多数为需氧菌或真菌。

1.7 模拟介质的灭菌
验证的结果受模拟介质无菌性的影响很大，若不能保证它的无菌性，或在验证之前受到了污染，则不能保证验证结果的可信性。模拟介质在使用之前应灭菌。灭菌的方法很多，如γ射线灭菌，湿热灭菌等等。不管是哪种灭菌方法，在确定灭菌参数后都应对这种灭菌方法进行验证。比如验证γ射线灭菌，应先测生物负荷量，根据生物负荷量得到所需要的吸收剂量。吸收剂量应经确认，可以用微生物吸收剂量计或者化学吸收剂量计确认吸收剂量。

1.8 培养基的灭菌
shou先选择一种培养基灭菌的方法。一般地，培养基灭菌方法有γ射线灭菌法和湿热灭菌法，选用的灭菌方法应做验证。培养基灭菌后应做生长促进试验。根据标准操作规程制备大豆酪蛋白消化物培养基并灭菌，将灭菌后的培养基分装于预定数量的试管中(此数量应有统计学意义)，在一半数量的试管中接枯草芽孢杆菌，接种量<100CFU；在另一半数量的试管中接种白色念珠菌，接种量<100CFU，接种后盖塞，封口并在32.5±2.5℃和22.5±2.5℃分别培养7天，7天内**少50%以上接种的各试管培养基中应出现明显的所接种微生物生长。#p#分页标题#e#


2 验证的实施

2.1 标准操作规程的确认以及人员培训
标准操作规程(SOP)是指导操作人员进行某项操作的书面程序，是操作人员的操作标准，是生产操作成功的关键。标准操作规程应能对操作人员提供足够的指导以完成本项操作。标准操作规程应由技术人员编写，部门主管审阅，质量保证部主管批准。将批准后的标准操作规程对操作人员进行培训，使之真正理解并能熟练掌握。标准操作规程的原件及培训记录存放在资料管理部门，操作现场存放的是复印件。验证前应确认每一项操作有标准可依，以免造成管理上的漏洞，且确认这项操作已被培训过，且操作人员已能熟练掌握。验证之前应对所有的操作人员和质量管理人员培训与验证有关的各项操作(可根据验证方案和SOP)，以避免验证过程中有关人员不理解甚**不知道怎么做，保证验证的顺利实施。如果新增加或调换了岗位操作人员，应重新做无菌工艺验证，以保证无菌操作能顺利进行。人是生产中**重要的因素，也是容易被忽略的因素，这一点应特别值得注意。

2.2 仪表校正
生产中的各项参数都是根据仪表来读取的，由一个没有校正过的仪表得到的参数或结果是不可靠的。由没有校正过的仪表得到错误的结果而导致生产中的异常，这样的情况并不少见。仪表校正应由有资格的人员或单位来进行，并符合G家可追踪的标准。仪表的校正频率**少符合G家规定，并要根据使用频率调整并严于此标准。使用频率越高，仪表的磨损越厉害，校正频率就应越高。由没有经过校正的仪表得到的数据无效。

2.3 工艺条件
无菌原料药的生产工艺具有其自己的特点：设备种类多，设备复杂，管路长，且不同的生产工艺有不同的特点，根据各自的特点选择固体或液体模拟介质。虽然尽量减少设备的内部暴露和减少物料产品的暴露，但是不可避免的会有一些设备与外界环境相通，或是物料暴露在环境中，这些开口处应有呼吸器或百级层流空气的保护。验证时应有模拟这些物料暴露的操作。有些生产工艺中具有结晶的操作，这使得模拟过程有些困难，因为结晶过程中有相变产生，这种变化是否会影响到微生物的生长是一个值得考虑的问题。**好的办法是选择两种模拟介质，它们在结晶过程发生反应生成另一种模拟介质。选择这样的介质可能会有很大困难。简单起见，也可用同一种液体模拟介质模拟结晶过程流经所有管路加到结晶罐中。若结晶过程有加晶种的操作，模拟过程中也应有这样的操作。晶种可用模拟介质代替。为使晶体粒度均匀，有些结晶过程有降温过程，在模拟过程中不应降温，因为微生物在低温下不易生长。干燥过程中的温度一般会抑制微生物生长，甚**将微生物杀死，在模拟过程中应保持室温，以免温度太高杀死细菌而使验证失败。也有用冷冻干燥除去湿分的，在这种情况下,模拟冻干参数的选择也不应使细菌的生长受到抑制。总之，在验证过程中尽量使工艺参数和实际情况一致，但是为了使细菌生长，允许选择的工艺参数和实际情况不一致，但是这些参数不应和生产工艺产生重大差别。无菌原料药的分装剂量一般较大，在这种情况下在分装过程中应减慢分装速度，以增加产品暴露的机会，在**差状况进行操作。

2.4 操作时限
在原料药的生产中每一操作都应有操作时限来保证已灭菌的物品避免受到微生物的污染或产品降解。操作时限越长，产品受污染的几率越大。在无菌工艺验证时，应将操作时限调整****大，在**差状况下操作，如果这时验证结果是可靠的，那么在小于此时间下进行的操作当然也是可靠的。尤其是已灭菌物品由灭菌到使用时的保存时间更加重要。在验证时，应将已灭菌物品**少放置到规定的保存时间，这样的验证结果更具有说服力。每一步操作都应延长**甚**超过操作时限，这样会使得总的工艺时间很长，但是这样的验证结果更能保证正常生产时的无菌状态。

2.5 环境监测
在验证过程中环境的质量是**关重要的，应在恶劣的环境下进行操作，但是不能恶劣到使产品发生染菌的程度。一般地，采用增加操作人员的数量的办法恶化环境。应对环境进行监测以评价验证过程，所有暴露产品的操作都有监测本区域的环境。环境监测包括以下几个项目：菌室的温度、湿度、换气次数、尘埃粒子、沉降菌、浮游菌、人员和表面微生物。沉降菌和浮游菌用培养皿进行测试，培养基为营养琼脂。这种方法简单且价格便宜。培养皿应放置在微生物监测史上情况**差的部位。在验证过程中应增加取样的频率，并且应在分装区域放2个以上的取样培养皿连续暴露取样，暴露时间应为分装的全过程，但不宜超过4个小时，否则营养琼脂变干而不能提供足够的营养使细菌不能长出。营养琼脂在使用前应做微生物生长促进试验，方法同培养基的生长促进试验，以保证营养琼脂对微生物生长的适应性。在环境监测中使用了不适当的营养琼脂培养基，微生物没有长出来，产生了假的好的结果这种情况也时有发生，这使得生长促进试验尤为重要。测试浮游菌可以用缝隙-琼脂撞击采样法、离心采样法、液体撞击采样法及膜过滤法。一般说来，浮游菌比沉降菌更能反映环境的质量。表面微生物的测试可用擦拭法或Rodac碟。用擦拭法测表面微生物之前应先测回收率。影响回收率的因素很多，包括微生物的种类和数量，不同的操作人员进行测试会得到不同的回收率，主要原因是擦拭时用力的大小，这里建议每个操作人员有自己的回收率数值。测试回收率时不要选择生命脆弱的微生物，因为这些微生物被擦拭时会死去，产生不可信的结果。用Rodac碟测试表面微生物比较方便，但是这种测试会有营养物质残留在被测试的表面，应清洗干净，否则这是一个很大的污染。尘埃粒子测试可以采用不同类型的粒子计数器，目前G际上采用Royco，Climat，Coulter等。尘埃粒子监测的结果应能证明产品暴露的关键区域空气质量达到了100级洁净区的空气质量标准。我G有指导环境监测的G家标准，G际上流行的标准是FS209E，它对环境监测及结果评价给出了很详细的指导。#p#分页标题#e#

2.6 工艺过程的模拟
由于一般原料药生产工艺都经过结晶过程，其间会发生相变，因此，无菌工艺验证不可能完全按照原来的实际工艺来进行模拟。可采用分步骤完成的方法：(1)从原材料配制起，以水代料，不加原料，完全用纯化水。经过除菌过滤、结晶、过滤、洗涤几个步骤后，从过滤器底部将水放掉。(2)放掉水后，将过滤器蒸汽灭菌，然后加入灭菌的模拟介质。以下的干燥、粉碎、分装步骤再按生产工艺进行。生产过程中可能有升温、降温过程，此时应注意模拟介质对温度的敏感性。可通过实验室考察。

2.7 工艺各步骤中的取样
根据各自的生产工艺在每个工艺步骤中比如结晶、过滤、干燥等都应取样测试无菌，以评价该步骤的无菌性能，为发现解决无菌问题提供足够的数据指导。取样频率和数量应有代表性，否则测试结果失去统计学意义。样品在从取出到测试的时间里不应被污染，尤其是液体样品污染的途径很多可能性很大，诸多因素中时间是一个重要因素，样品取出后**好立即测试，以免防止时间过长而被微生物污染。

2.8 样品培养
阴性对照:在验证过程中，随机取出有代表性的一定数量的装有培养基的包装容器作为阴性对照。阳性对照:验证过程中，随机取出有代表性的一定数量的装有模拟介质的包装容器，一半接种浓度为<100个微生物/0.1ml的枯草芽孢杆菌，另一半接种浓度为<100个微生物/0.1ml的白色念珠菌。接种后分别在适宜的温度下培养7天，7天内**少50%的接种包装容器中有明显的所接种微生物的生长，以此作为阳性对照。样品培养：将分装得到的产品在操作现场灌装培养基，然后密封，检查密封性。全部产品应在适宜的温度下培养14天，14天时检查培养的全部样品的微生物生长情况。若发现污染应注明批号，包装容器号，同时检查密封情况。若有破损注明原因。污染的样品应做微生物鉴别，**少鉴别到种。

2.9 结果评价
在制剂中以污染水平不过0.1%为接受标准，但是在无菌原料药生产中，包装单位较大，得到的总分装容器数一般较小，这使得抽样测试和结果计算失去统计学意义。又因为生产批量是固定的，因此所有产品都应被培养。若发现有一个容器长菌，就认为无菌生产工艺中有染菌的因素存在，应立即停产，调查产生污染的原因，采取措施后重复做验证。这样的做法在无菌原料药的无菌生产工艺验证中是可以接受的。本验证**少连续三批全部合格才可以认为此无菌生产工艺符合无菌要求。

3 **终报告
验证完成之后应起草一份**终报告，对以上内容做一个简要总结，包括以下内容：验证题目、参加验证部门和人员、采用的工艺参数和操作时限、选择的模拟介质和培养基、培养条件和**终结果、**终报告应由企业质量保证部主管批准。只有当**终结果合格并且**终报告经过批准后，企业的无菌原料药生产才能开始(或继续)进行。

4 再验证
再验证的目的就是保证无菌生产工艺没有随生产的运行产生污染的因素。应有标准操作规程(SOP)对再验证的频率做规定。一般说来，新生产线在投产之前要做无菌工艺验证，验证通过后该生产线才能投入使用。正在运行的生产线应每年**少做2次无菌工艺验证，每个操作人员每年**少参加一次无菌工艺验证。直接接触药品的生产岗位操作人员若有变动，应对产品的无菌工艺做再验证。