外植体的消毒与无菌苗的培养

一、目的
通过在超净工作台上进行无菌操作训练,初步掌握组织培养的无菌操作技术及外植体的消毒灭菌技术
二、原理
灭菌是组织培养中重要的工作环节之一,是指采用理化手段杀死物体表面及其孔隙内的一切微生物,包括细菌的芽孢和真菌的孢子。组织培养中要求无菌室、超净工作台达到无菌状态,植物材料也要经过消毒灭菌后再接种,接种人员的双手同样如此。
无菌室和超净工作台可采用甲醛、高锰酸钾混合薰蒸,结合紫外灯照射20~30分钟;外植体可采用70%酒精和10%的次氯酸钠杀菌;双手可用70%的酒精棉球擦拭;接种工具可采用70%酒精棉球擦拭,再经火焰灼烧灭菌。
MS培养基中包含有植物生长所需的各种营养元素,可为离体培养的生物材料提供近似于生物体内及外界生长生存的营养环境。当植物材料灭菌后即可在适宜的培养基、适宜的温度条件下生长。
三、试剂及器材
超净工作台、酒精灯、镊子、无菌培养皿、无菌滤纸、无菌蒸馏水、无菌小烧杯、10%次氯酸钠、70%乙醇、废液缸、酒精棉球、打火机
四、操作
(1)准备工作:配制MS基本培养基,备用。
(2)用酒精棉球将超净台的操作表面擦拭干净。
(3)将实验器材及试剂放入超净工作台中,紫外灭菌25-30min。
(4)灭菌后打开超净风,吹5min。
(5)洗净双手,进入无菌室。在超净台内点燃酒精灯,用酒精棉球反复擦拭双手,尤其要注意关节部位;超净台的表面也要用酒精棉球单方向擦拭(一般由里到外)。
(6)取适量种子置于100/50ml烧杯中,用70%的乙醇消毒30s-1min,然后将酒精倒入废液缸中,加入无菌水,轻轻晃动,清洗1-2min后,将无菌水倒入废液缸中。
(7)将10%次氯酸钠(NaClO)加入烧杯中,消毒10 min,期间不时晃动烧杯,使种子充分接触消毒剂;然后将NaClO溶液倒入废液缸中,加入无菌水,轻轻晃动,清洗3-4min后倾去,如此重复3-4次。
(8)将种子置于垫有滤纸的无菌培养皿中,吸干种子表面的水分。在整个操作过程中镊子和解剖刀要多次火焰消毒,冷却后再使用。
(9)接种:每瓶接种种子10粒。接种时,应在酒精灯旁操作,锥形瓶口应斜向火焰;接种好后,将锥形瓶的瓶口在酒精灯火焰上转动地烧一遍,封盖瓶口,然后用线绳将瓶口扎牢,以免微生物进入,造成污染,导致培养失败。
(9)接种结束后,清理和关闭超净工作台。
(10)将培养瓶放置于25℃光照培养箱/培养室培养并观察。
五、结果
1、观察种子的生长情况。
2、统计污染率、污染种类。
 

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