苏州安泰超净工作台在茶多酚影响乳腺癌组织C-Jun 蛋白表达研究中的应

茶多酚影响乳腺癌组织C-Jun蛋白表达研究
1 材料
1.1 动物与细胞系:雌性BALB/c 小鼠60 只,体重(20±2)g,购自上海斯克莱实验动物有限公司[许可证号:SCXK(沪)2003-0003],并在南京中医药大学动物中心屏障系统SPF 环境下饲养。EMT6 小鼠乳腺癌细胞购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心。
1.2 药物:茶多酚购自浙江东方茶业有限公司,纯度98%(批号:20050334);人参皂苷Rg3(参一胶囊)每粒含人参皂苷Rg3 10 mg,购自吉林亚泰有限公司(批号:20040704)。
1.3 仪器:超净工作台苏州安泰空气技术有限公司生产(型号sa-cj-zFD);离心机由上海安亭科学仪器厂生产(型号KA-1000);莱卡倒置显微镜为德国莱卡公司产品(型号 DMIL);Forma 恒温培养箱为美国Forma 公司产品(型号3111)。
1.4 试剂:c-jun Oncoprotein 抗体由美国CASTRATM 公司提供(批号:105205);免疫组化超敏鼠组织试剂盒(UltraSensitiveTMS-P)购自福州迈新生物技术开发有限公司。
2 方法
2.1 细胞培养与接种:EMT6 细胞用含10% 小牛血清的RMPI1640 培养液培养,细胞长满单层后用0.25%胰酶消化,培养液吹打离心,收集细胞用PBS 稀释,浓度调至5×106,每只小鼠以0.2 ml 接种于小鼠右后背部。12 天后肿瘤长至1g 时移植。
2.2 肿瘤移植:断颈处死荷瘤小鼠,75%酒精浸泡3~5min 后放于超净工作台平皿中,用高压灭菌的手术器械剪开肿瘤皮肤,分离肿瘤包膜,取出肿瘤以消毒后的PBS 清洗,称重,按每克肿瘤4ml 溶液的比例用生理盐水稀释。剪碎瘤体,充分匀浆制成细胞悬液,浓度调至2×106,每只小鼠于右后背部皮下接种0.2ml。
2.3 分组及用药:接种第13 天肿瘤长至1mm3 时(成瘤48 只),随机分为4 组,即茶多酚灌胃组、茶多酚局部注射组、人参皂苷Rg3 灌胃组,模型对照组。每组12 只动物。所有给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定。即:①茶多酚灌胃组:按人治疗量900mg/d 计算,换算成实验用药中剂量为11.25mg/kg,并按小鼠体重20g 计算,以2.25mg/d 配置浓度5.625mg/ml,每天灌胃0.4ml。②茶多酚局部注射组:参考茶多酚腹腔注射LD50 160mg/kg剂量,取其1/4 量为实验用小剂量组,换算成实验用药中剂量为12mg/kg,以2.4mg/d 配制浓度24mg/ml,每天局部注射0.1ml。③人参皂苷Rg3 组:按人治疗肿瘤剂量40mg/d 计算,换算成20g 小鼠剂量为0.1mg/d,配制浓度为0.25mg/ml,每天灌胃0.4ml。④模型对照组:生理盐水灌胃,每天0.4ml。在接种第13 天开始给药、给水,每日1 次,连续给药10 天。第11 天处死小鼠,取肿瘤组织制备切片待捡。
2.4 原癌基因蛋白C-Jun 检测:将肿瘤组织取出后迅速放置于10%福尔马林溶液中固定,第二天脱水,石蜡包埋,连续切片为4um 厚,其中取一张做HE 染色,其余每组选取3 个组
织切片,按相关试剂盒说明检测C-Jun 表达。用PBS 作为一抗做阴性对照。各组选取肿瘤组织3 个组织切片,每片选3 个视野,用美国TN-8502 图像分析系统作图像分析,测定光
密度(IOD)值,取其平均值,以均数±标准差(x ± s)表示。
2.5 统计方法:实验数据用SPSS11.5 计算机统计软件进行t 检验,当P<0.05 时表示差异有显著性,当P>0.05 时表示无统计意义。

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