二级生物安全柜生物挑战性试验

•2003年的非典疫情及2004年四月国家CDC的SARS实验室感染事件之后,生物安全柜的重要性及生物安全实验室建设的迫切性已勿须多言。但由于历史原因及经济条件的不足,我国在生物安全领域内的相关标准规范相对薄弱。
•2004年国家制定了《实验室生物安全通用要求》GB19489-2004,对在二级生物安全柜在现场安装、移动、检修后等情况下规定的必测项目也仅规定了垂直气流速度断面测定、工作窗口进风风速测定、烟雾试验、高效空气过滤器检漏试验等几项指标,而对微生物污染模拟试验(挑战性试验)(KI-Discus 测试)未作要求,国内相关的试验报道也不多。为此,我们进行了一次现场微生物试验,目的在于探讨二级生物安全柜在现场使用时各项生物指标的安全性. 
•参照欧盟标准EN12469-2000 《生物技术-生物安全柜技术要求》和美国标准NSF49-2002《ClassⅡ(层流)生物安全柜》
•包括三方面的试验:
•1、人员保护试验
•2、产品保护试验
•3、交叉污染保护试验
•06年实施的YY0569-2005《生物安全柜》相关内容基本参照了上述两个标准
•1材料和方法
•1.1材料:生物安全柜:苏州安泰空气技术有限公司生产的BHC-ⅡB2型生物安全柜;试验菌株: 枯草杆菌芽孢ATCC9372
•1.2方法
•1.2.1:交叉污染测试:确定安全柜在防止产品在同一工作室内互相细菌传播污染的保护功效。见图1
•试验用圆筒的设置:在安全柜操作台面的中央放置一直径100mm的不锈钢圆筒,模拟实验时操作人员的手臂,一端紧靠安全柜的后壁,一端伸出安全柜工作窗150mm。

•喷雾器的设置:将含有55ml枯草杆菌芽孢菌混悬液(5×104/ml)的喷雾器置于安全柜左侧面中央离操作台面向上100mm处,喷雾器背面紧靠内壁。培养皿的设置:在喷雾器喷嘴的下方台面往右侧方向排列两个对照皿,紧靠对照皿右侧排三列φ90mm试验皿。每列5个。见图
•采样程序:安全柜运行30min后开始试验。取下培养皿盖子,启动喷雾器喷菌5min,喷菌量≥1ml/分钟。喷雾器停止5min后,将培养皿盖上。
•细菌培养:培养皿及对照皿在37℃环境中培养48h计算菌落数。
•在安全柜操作台右侧同样方法重复一遍。
•1.2.2、产品保护测试:确定如果细菌释放于工作室外,安全柜内部是否会受污染。见图2
•试验用圆筒的设置:同1.1.1。
•喷雾器的设置:将含有55ml枯草杆菌芽孢菌混悬液(5×106/ml)的喷雾器置于安全柜操作窗外侧的水平中心,水平喷射轴在工作台面向上350mm处,平行于工作面,喷嘴距工作窗外侧100mm,并朝向工作窗。

•培养皿的设置:将40个φ90mm培养皿放置在安全柜台面实验用圆筒中轴线两侧(每侧4列共20个平皿),另将1个对照皿放置于工作区前回风凹槽的上方。

•采样程序:安全柜运行30min后开始试验。取下培养皿盖子,喷菌5min,喷菌量≥1ml/分钟。喷雾器停止5min后,将培养皿盖上。
•细菌培养:培养皿及对照皿在37℃环境中培养48h计算平均菌落数。
•1.2.3、人员保护试验:确定如果在工作室内有细菌被释放时,安全柜对此的密封保护性。
•试验圆筒的设置:同1.2.1,圆筒中心轴下方、位于前窗操作口进分隔删的上方放置一个阳性对照皿。

•喷雾器的设置:将含有55ml枯草杆菌芽孢菌混悬液(5×108/ml)的喷雾器置于操作柜内左右内壁的中央,水平喷射轴在工作台面上方350mm处,平行于工作面。喷雾器的喷嘴距工作窗内侧100mm处朝向工作台。喷菌量≥1ml/分钟。 
•撞击采样器的设置:操作窗外测人员所在区域设6个撞击式采样器,空气采样量为12.5升/分钟。内盛20ml无菌蒸馏水,采样口设置在安全柜工作窗外侧63mm处。其中两个采样口的轴心线相隔150mm,分别位于试验圆筒的两侧并于试验圆筒等高;两个采样器的轴心线相隔50mm,分列试验圆筒的两侧于圆筒下沿30mm的 水平面上,另两个采样器轴心线相距300mm,水平面位于工作台面向上360mm。两个狭缝采样器的设置:采样口与安全柜工作台面齐平,垂直轴线距安全柜操作窗向外150mm,分别距左右两侧的内壁200mm。内置φ150mm的培养皿各一个,空气采样量为28.3升/分钟。见图三
•采样程序:生物安全柜运行30min后开始试验。采样程序见表1:
•表1:采样程序
•时间(min)        试验步骤
       0                    开启狭缝采样器
       5                    开启喷雾器
       6                    开启撞击采样器
      11                   停止撞击采样器
      11.5                停止喷雾器
      30                   停止狭缝采样器
•细菌培养:采样后所有撞击采样器的采样液在无菌条件下用一直径47mm孔径为0.22μm的滤膜过滤后,取出滤膜置于有营养琼脂的φ90mm的培养皿。把置有过滤膜的培养皿、两个狭缝采样器的培养皿及对照培养皿在37℃环境中培养48h读菌落数。
•每次试验之间对操作台内外用1%过氧乙酸溶液擦拭15分钟,安全柜运行30分钟以上。试验重复三次. 
•2结果和讨论:培养48小时后计算平均菌落数,见表2
•                   表2: 检测结果
•      检测项目                           实测值       阳性对照
 1: 交叉污染测试
 细菌菌落总数(CFU/每次)    <1、  <1    1140、900
2:产品保护测试         
细菌菌落总数(CFU/每次)         <1                1080 
 3:人员保护测试
撞击式样采样器
细菌菌落总数(CFU/每次)         2                   1680
狭缝式采样器
细菌菌落总数(CFU/每次)         <1      1          1680
•虽然安全柜的安全性可以通过常量气流和过滤测试来获取相关数据,但在实际使用中却未必能发挥令人满意的效果,因此,以上三个微生物测试评估显得很重要。我们通过对安全柜进行的模拟喷菌试验,获取了相关信息,按美国标准NSF49-2002和欧盟标准EN12469-2000,在人员保护试验中,撞击式采样器的菌落总数应≤10CFU/每次,狭缝式采样器菌落总数应≤5CFU/每次,产品保护护试验的标准为菌落总数≤5CFU/每次,交叉污染试验的标准为≤2CFU/每次,本次试验的结果表明国产生物安全柜在安全性方面已达到了国际通用要求。
•生物安全柜的应用越来普及,也应该引起更加的重视,而生物安全柜在制造、现场安装、使用等各个环节有很多因素影响其安全性,除了经常性的物理指标检测外,生物挑战性测试是很有必要的。

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