苏州安泰净化工作台在一种简单、经济、高效的大量肝细胞培养方法中

一种简单、经济、高效的大量肝细胞培养方法

1材料与方法
1.1 实验材料 昆明种封闭群乳小鼠由泸州医学院 动物科提供。DMEM培养基、新生小牛血清均购于 Hvclone公司。碱性品红、偏重亚硫酸钠、过碘酸(AR) 均为上海试剂厂生产。二氧化碳培养箱(98008444,U. S.A),超净工作台SW-CJ-1F苏州安泰空气技术有限公司),倒置显微镜(XST—D,重庆光学仪器厂),超 纯水仪(Maxima型,英国)。
1.2 方法
1.2.1 肝组织块的获得与培养取1~3 d的乳小鼠 5只,于超净工作台内消毒,剖腹,取出肝组织,切割 为约l mm3的碎块、PBS(10 mmol/L,pH7.4)清洗,然 后移入玻璃离心管内。用眼科剪剪碎至糊状,加入5 倍体积的0.1%胰蛋白酶,置37℃下消化10 min,其间 不时振摇。然后静置待组织块沉淀,弃上清液,Hanks 液洗组织块2次,以除去血细胞及其他细胞;最后再 用少许10%小牛血清DMEM培养液洗1次,以充分终 止酶的活性。在消化好的肝组织块内加少许培养液, 混匀后平均转移于5个培养瓶(50 mL)内,使组织块 均匀分布,置37℃、5%CO:孵箱内孵育3 h,组织块贴 壁后再补加10%小牛血清培养液4 mL/瓶,继续培养, 每两天换培养液1次,并观察细胞生长情况。
1.2.2肝细胞的传代培养 大约6~7 d肝细胞长满 瓶底,即可传代。倒去原培养液,加消化液(0.25%的胰 蛋白酶,O.02%的EDTA)覆盖瓶底,倒置显微镜下见细 胞变圆(约3。5 min),立即倒掉消化液,加10%小牛 血清培养液洗1次.再加10%小牛血清培养液4 mL 轻轻吹打约3 min后。静置使组织块沉淀,转移上层 细胞悬液于另一干净培养瓶继续培养。每两天换培养 液1次。并继续观察细胞生长情况。 原培养瓶去除组织块后,于倒置显微镜下见有散 在细胞贴附于瓶底.多为梭形、三角形、星形等变形细 胞.采用PAS染色法【z】对原培养瓶内残留细胞进行染 色.大多细胞胞质中未见粉红色糖原颗粒,核呈空泡 状。继续采用H.E复染胞核,可见空泡状的核染成紫 蓝色,未见有双核细胞(图la,本文照片见封三)。

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